高純度質(zhì)粒大量快速提取試劑盒
HighPure Rapid Maxi Plasmid Kit
保存條件:本產(chǎn)品收到后按照上面指示溫度存放各成份,儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹:
本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除,后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
3. 獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、超螺旋比例高、純度好,可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1. 第--次使用時(shí),將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入溶液 P1 后(終濃度 100μg/ml) 置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活,提取的質(zhì)粒可能會(huì)有微量 RNA 殘留, 在溶液 P1 中補(bǔ)加 RNase A 即可。
2. 環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀,可在 37℃水浴加熱幾分鐘,即可恢復(fù)澄清,不要?jiǎng)×覔u晃,以免形成過量的泡沫。
3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。
4. 溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套,避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí),要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)??截悢?shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?;虼笥?10kb 的大質(zhì)粒,應(yīng)加大菌體使用量,同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量, 洗脫緩沖液應(yīng)在 70℃預(yù)熱??梢赃m當(dāng)?shù)难娱L吸附和洗脫的時(shí)間,提高提取效率。
自備試劑:無水乙醇操作步驟:
ð 第--次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 瓶中加入 200ml 無水乙醇,充分混勻,加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入!
ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中,混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。
ð 將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷。
1. 柱平衡步驟:向吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中)加 1ml 平衡液 BL,12,000rpm
離心 1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。(請(qǐng)使用當(dāng)天處理柱子)
2. 取 100-200 毫升過夜培養(yǎng)的菌液,6000xg 離心 10 min,盡可能的倒干上清,收集菌體。
3. 用 7ml 溶液P1 重懸菌體沉淀,移液器吹打或者渦旋振蕩至*懸浮。
4. 加 7ml 的溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解,室溫放置 4 min。
5. 加 10ml 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次,充分混勻此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置 5-10 min,4℃條件下 2500xg 離心 20 min(加大離心力可相應(yīng)縮短離心時(shí)間, 如 15000xg 離心 10 min),小心取上清,避免吸取到漂浮的白色沉淀。
6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中),靜置 2 min,2500xg
離心 2 min,倒掉收集管中的廢液。
7. 加入 10ml 去蛋白液 PD,2500xg 離心 2 min,棄掉廢液。
8. 加入 10ml 漂洗液 WB(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!),2500xg 離心 2 min,棄掉廢液。
9. 重復(fù)操作步驟 8。
11. 可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子:
a. 取下柱子放置于真空容器中,密封真空容器,提供真空 15 min;
b. 將柱子放置于 60-65℃真空干燥箱或烘箱中,放置 10-15 min。
12. 取出吸附柱 AC,放入一個(gè)干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加 1-1.5ml 洗脫緩沖液EB(事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好),室溫放置 2 min,6000xg 離心 5 min。需要較多量質(zhì)粒,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,離心 2 min。(注意:洗脫液的 pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響。(注意:若用 ddH2O 做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 7.5-8.0 圍內(nèi),pH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實(shí)驗(yàn)所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于 1 ml,體積過小影響回收效率。DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,以防 DNA 降解。)
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目