動物組織/細胞RNA提取試劑盒(DNase I)說明書
RNApure Tissue Kit(DNase I)
動物組織/細胞RNA提取試劑盒(DNase I)
目錄號:K0560
保存:DNase I、10×Reaction Buffer:-20℃
其它組分:室 溫
組分說明
Cat.No. K0560
KitSize 50
DNaseI 1000U
10×ReactionBuffer 1000 μl
BufferRL 35ml
BufferRW1 40ml
BufferRW2(concentrate) 11ml
RNase-FreeWater 10ml
SpinColumnRM 50
CollectionTube(1.5ml) 50
CollectionTube(2ml) 50
產(chǎn)品簡介
本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術與硅基質(zhì)膜純化技術相結合,可從動物細胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般多 30mg 組織或 1x107 細胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA,幾乎無 DNA 殘留。如果要進行對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗,殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染,應注意以下幾方面:
1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3)配制溶液應使用無RNase的水。
4)操作人員戴一次性*罩和手套,實驗過程中要勤換手套。
2. 提取的樣品避免反復凍融,否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。
3. BufferRL 在使用前請加入β-巰基乙醇,1mlBufferRL 加 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 BufferRL 室溫可保存1 個月。
4. 第-次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 BufferRW2 中加入無水乙醇。
5. BufferRL 如果產(chǎn)生沉淀,可于 56℃加熱使其溶解后室溫放置。
6. 所有離心步驟均在室溫下進行,且所有操作步驟動作要迅速。
自備試劑: β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA)
操作步驟
1. 樣品處理
1a. 組織:將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600 μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇),組織樣本少于20 mg加350 μl Buffer RL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。
1b 單層培養(yǎng)細胞:將細胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細胞懸液,離心得到細胞沉淀,棄上清,每6-10 cm 2培養(yǎng)面積加入600 μl Buffer RL,小于6 cm2 加入350 μl Buffer RL,反復吹打幾次,使其充分裂解。
1c. 細胞懸液:12,000rpm6(~13,400×g)離心1分鐘棄上清,得到細胞沉淀。每5×106 -1×107 細胞加入600 μl Buffer RL ,少于5×106細胞加入350 μl Buffer RL,反復吹打幾次,使其充分裂解。
注意:1)盡量除盡細胞培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)基可能抑制細胞的裂解影響RNA產(chǎn)量。
2)盡量使細胞充分懸浮并充分裂解,否則影響RNA產(chǎn)量。
2. 樣品充分裂解后,室溫放置5分鐘,使蛋白核酸復合物*分離。
3. 12000rpm離心2-5min,取上清進行以下操作。
4. 向步驟3中得到的溶液中加入1倍體積(600 μl 或350 μl)的70%乙醇(無RNase水配制),混勻。
注意:加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀,不會影響后續(xù)實驗。
5. 將上步所得溶液全部加入到吸附柱(SpinColumnRM)中(吸附柱已裝入收集管CollectionTube中),若一次不能將全部溶液加入吸附柱中,請分兩次轉(zhuǎn)入,12,000rpm離心1分鐘,棄廢液。將吸附柱放回收集管中。
注意:吸附柱的大載量為100µg,不要超載,否則會影響RNA的產(chǎn)量和純度。
6. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1,10,000rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制DNaseI 混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I(1U/μl),混勻,配制成終體積為80 μl的反應液。
8. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液,20-30℃孵育15分鐘。
9. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1,10,000rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇),12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢
液,將吸附柱放回收集管中。
11. 重復步驟10。
12. 12,000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以*晾干。
注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(酶切、PCR 等)。
13. 將吸附柱轉(zhuǎn)入新的RNase-Free的1.5ml 收集管中,向吸附膜中間位置加入30-50 μl RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,12,000rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。
注意:1)RNase-FreeWate體積不應小于30 μl,體積過小影響回收率。
2)如果要提高RNA的產(chǎn)量,可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重復步驟13。
3)如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復步驟13。