質(zhì)粒小量快速提取試劑盒
Rapid Mini Plasmid Kit
試劑盒組成 | 保存 | DP101-01 100 次 | DP101-02 200 次 |
平衡液BL |
室溫 |
60ml |
120ml |
RNaseA(10mg/ml) | 室溫 | 300µl | 300µl×2 |
溶液 P1 | 4℃ | 30ml | 30ml×2 |
溶液 P2 | 室溫 | 30ml | 30ml×2 |
溶液 P3 | 室溫 | 40ml | 40ml×2 |
漂洗液WB |
室溫 | 25ml 25ml×2 第-次使用前按說(shuō)明加指—*定量乙醇 | |
洗脫緩沖液 EB | 室溫 | 15ml | 10ml×2 |
吸附柱AC | 室溫 | 100 個(gè) | 200 個(gè) |
收集管(2ml) | 室溫 | 100 個(gè) | 200 個(gè) |
保存條件:本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹:
本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH 值狀
態(tài)下選擇性地
結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA,再通過(guò)漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除,后低鹽、高 pH 值
的洗脫緩沖液
將純凈質(zhì)粒DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復(fù)
性好??朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯-*仿等試劑,也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好,可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1.第-次使用時(shí),將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 后(終濃度 100ug/ml) 于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活,提取的質(zhì)??赡軙?huì)有微量 RNA 殘留, 在溶液 P1 中補(bǔ)加 RNase A 即可。
2.環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì)析出渾濁或者沉淀,可在 37℃水浴加熱幾分鐘, 即可恢復(fù)澄清,不要?jiǎng)×覔u晃,以免形成過(guò)量的泡沫。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。
4.本試劑盒適用菌株為 XL-1 Blue 和 DH5a 等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株為JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株,核酸酶含量豐富,應(yīng)購(gòu)買(mǎi)本公司生產(chǎn)的高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒。
5.溶液 P3 中含有刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套,避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí),要用大量清水或者生理鹽水沖洗。提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)??截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒,建議接種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養(yǎng)基,過(guò)夜培養(yǎng) 14-16 個(gè)小時(shí),可提取出多達(dá) 20µg 的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?;虼笥?/font> 10kb 的大質(zhì)粒,應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量,使用 5-10ml 過(guò)夜培養(yǎng)物,同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量,其它步驟相同。
6.得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶,也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶,這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成,與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò) 90%。
7. 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA,不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫, 但應(yīng)該確保 pH 大于 7.5,pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在-20℃。質(zhì)粒DNA 如果需要長(zhǎng)期保存,可以用 TE 緩沖液洗脫(10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH 8.0),但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng),使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。
自備試劑:無(wú)水乙醇
操作步驟:
ð 第--次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 中加入指-*定量無(wú)水乙醇,充分混勻,加入后請(qǐng)及時(shí)在
方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入!
ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中,混勻,每次使用后置于 2-8℃保存。
ð 將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷,可以提高產(chǎn)量。
1. 向吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中)加 500μl 的平衡液 BL,12,000pm 離心 1 min,倒掉
收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
2. 取 1.5-4.5ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液 12,000rpm 離心 30 sec,盡可能的倒干上清,收集菌體。
3. 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀,渦旋振蕩至*懸浮。
4. 加 250μl 的溶液 P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解。
5. 加 350μl 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4-7 次,充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀,
12,000rpm 離心 5 min,小心取上清。
6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm 離心30-60 sec,
倒掉收集管中的廢液。
7. 加入 500μl 漂洗液 WB(請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!),12,000rpm 離心 30 sec,棄
掉廢液。
8. 重復(fù)步驟 7。
9. 將吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 離心 2 min,將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,
以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。10.取出吸附
柱 AC,放入一個(gè)干凈的離心管中,室溫放置 10 min。
11.在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB(洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱
效果更好),室溫放置 2 min,12,000rpm 離心 1 min。如果需要較多量質(zhì)粒,可將得到的溶液
重新加入離心吸附柱中,離心1 min。洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較
高,可以適當(dāng)減少洗脫體積, 但是小體積不應(yīng)少于 30μl,體積過(guò)小降低質(zhì)粒洗脫效
率,減少質(zhì)粒產(chǎn)量。洗脫液的 pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
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| 染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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