貨號(hào): YJS2421 規(guī)格:50管/48樣
組織總磷含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
可見(jiàn)分光光度法
注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
磷的存在形態(tài)包括無(wú)機(jī)磷與有機(jī)磷。無(wú)機(jī)磷主要指磷酸根,參與生物體內(nèi)多種代謝,包括能量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化等。通過(guò)測(cè)定總磷與無(wú)機(jī)磷含量即可了解作物對(duì)磷的利用率,進(jìn)而為合理施肥提供依據(jù)。
測(cè)定原理:
總磷經(jīng)消化后,轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)磷。鉬藍(lán)法是測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量的經(jīng)典方法,一定條件下,鉬藍(lán)與磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物質(zhì),通過(guò)測(cè)定660nm光吸收,即可計(jì)算無(wú)機(jī)磷含量,進(jìn)而可計(jì)算出組織中總磷含量。
自備儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml玻璃比色皿、蒸餾水和濃硫酸。
試劑組成和配置:
試劑一:液體×1 瓶,4℃保存) (強(qiáng)腐蝕性,強(qiáng)氧化性)。
試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前配制,加入15mL蒸餾水,溶解后再加入10mL
試劑二,混勻。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1 支,20μmol/L 無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液,-20℃保存。
有機(jī)磷消化:
取帶蓋試管,進(jìn)入精確稱取的約0.1 g組織,加濃硫酸1.0 mL,蓋緊(防止水分散失)后沸水浴10min左右,待溶液呈黑色或棕色時(shí)取出。稍冷后,加試劑一200μL,充分混勻,蓋緊后繼續(xù)沸水浴,直到溶液呈透明狀,取出室溫冷卻后,加蒸餾水8.8mL,充分混勻;室溫,8000g,離心10min,取上清液待測(cè)。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 打開(kāi)水浴鍋,調(diào)節(jié)溫度到40℃。
3. 空白管:取EP管,依次加入500μL蒸餾水,500μL試劑三,混勻后置于40℃水浴保溫10min,室溫冷卻10min后于660nm測(cè)定吸光度,記為A空白管。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管:取EP管,依次加入50μL標(biāo)準(zhǔn)液,450μL蒸餾水,500μL試劑三,混勻后置于40℃水浴保溫10min,室溫冷卻10min后于660nm測(cè)定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 測(cè)定管:取EP 管,依次加入50μL上清液,450μL 蒸餾水,500μL試劑三,混勻后置于40℃水浴保溫10min,室溫冷卻10min 后于660nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
組織總磷含量計(jì)算公式:
(1) 按照蛋白含量計(jì)算
總磷含量(mmol/mg prot) = [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 總÷Cpr= 1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
(2) 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
總磷含量(mmol/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 總÷W= 1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)液:1 mmol/L;V 總:上清液總體積,10 mL=0.01 L;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;
W:樣品質(zhì)量,g。
注意事項(xiàng):
1. 試劑三需臨用前配制,并且當(dāng)天使用完畢。
2. 40min內(nèi)完成比色。
3. 最DI檢出限為10μmol/L。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):