Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)說(shuō)明書
6×His-Tagged Protein Purification Kit
目錄號(hào): K0894
保 存: 蛋白酶抑制劑混合物,-20℃; 其它組分,2-8℃。
組分說(shuō)明
Cat.No. K0894 K0894A
KitSize 2ml 5ml
Ni-Agarose 填料 2ml 5ml
細(xì)菌裂解液 25ml 65ml
1MTris(pH7.9) 6ml 15ml
1M 咪唑 25ml 65ml
3M 氯化鈉 50ml 2×60ml
蛋白酶抑制劑混合物 0.3ml 0.7ml
親和柱空柱 1個(gè)(6ml) 1 個(gè) (12ml)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒包含Ni-Agarose 填料、親和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白純化所需的全部試劑(細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分),使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有6 個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個(gè) Ni2+ 螯合位點(diǎn),較只有3 個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA 結(jié)合 Ni2+ 更為牢固,有效防止純化過(guò)程中 Ni2+ 脫落且增強(qiáng)對(duì) His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,提高純化效率。較高的基團(tuán)密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對(duì)來(lái)源于各種表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細(xì)胞,酵母以及細(xì)菌)中的His 標(biāo)簽蛋白,均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接用可溶性蛋白的純化,使用方便,快捷。
支 持 物: CL-6B 瓊脂糖凝膠
載量:20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料
粒徑:50-160 μm
注意事項(xiàng)
1. 在純化之前采用電泳檢測(cè)蛋白的可溶性,本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化,如需純化包涵體蛋白,請(qǐng)選擇我公司
的包涵體蛋白純化試劑盒,貨號(hào)為K0893。
2. 緩沖液中不建議使用 β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。
3. 整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。
4. 為提高純化效率,首先確定BindingBuffer 和 ElutionBuffer 中咪唑的最佳使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度,BindingBuffer 的范圍為0-10mM,洗脫緩沖液的范圍為10-500mM來(lái)進(jìn)行。并通過(guò)SDS-PAGE或WesternBlotting 來(lái)檢測(cè)目的蛋白的純度。
5. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過(guò)0.22µm 或者0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。為避免柱子被堵塞,建議將裂解液進(jìn)行離心,或者使用0.22µm 或者0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。
6. 柱再生時(shí),保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。
操作步驟
組裝層析柱
1. 將填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開,讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。
注意:(1)填料的上層是乙醇保護(hù)層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計(jì)算,取需要的填料與乙醇的混合 液加入層析柱。
(2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個(gè)外力,例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。
(3)本實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)重力作用使溶液流出。
2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用10 倍柱體積的Binding Buffer 平衡柱子,平衡結(jié)束后即可上樣。
注意:柱體積指的是填料的體積。
可溶性蛋白的純化(BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見附表1)
1. 收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml細(xì)菌裂解液(每1ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物),超聲裂解菌體。
注意:(1) 當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時(shí),建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1μlDNaseI(1,000U/ml),2μlLysozyme(50mg/ml),DNaseI和Lysozyme可單獨(dú)從我公司購(gòu)買,貨號(hào):Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A),如使用其它公司產(chǎn)品,請(qǐng)按照相應(yīng)說(shuō)明書操作。
(2)超聲過(guò)程中保持菌液處于冰浴中,超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率,探頭種類,容器的大小形狀,需實(shí)驗(yàn)中自己摸索,應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱,可分成短時(shí)間,多次超聲,通過(guò)一定的間隔時(shí)間避免溶液過(guò)熱。最終以菌液變清即可。
2. 10000rpm,4℃離心3分鐘,收集上清中的可溶性蛋白。
3. 用BindingBuffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時(shí),收集流穿液。
注意:(1)本試劑盒中附帶有一塊篩板,使用時(shí)先將篩板加至填料的上層,該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過(guò)濾,防止過(guò)多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱,但是篩板放入柱子后就不易取出。
(2)通過(guò)控制加入的菌體裂解液的速度來(lái)控制流速。
4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,洗去雜蛋白。
5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。
注意:洗脫峰可以分管收集,每1ml收集1管,并采用蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè),收集洗脫峰。
6. 洗脫后,依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。
注意:如果是分段梯度洗脫,最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500mM時(shí),則使用濃度為500mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后,再進(jìn)行第6步的操作。
柱再生
當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會(huì)有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色),可以用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
1. 使用2 倍柱體積的6M鹽酸胍沖洗后,使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。
2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。
3. 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗,再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。
4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。
5. 使用5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液(PH8.0)沖洗。
6. 使用3 倍柱體積去離子水,3 倍柱體積20%乙醇沖洗。
7. 4°C 保存。
8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5個(gè)柱體積的 50 mM NiSO4再生,3 個(gè)柱體積的Binding Buffer 平衡。
附表 1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方
成分 Tris-HCl(PH7.9) 咪唑 NaCl
SolubleBindingBuffer 20mM 10mM 0.5M
SolubleElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M
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