牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
牛傳染性胸膜肺炎又稱牛肺疫,是由絲狀支原體引起的一種急性或慢性、接觸性傳染病。以肺小葉間淋巴管漿液性炎癥,小葉間組織漿液性纖維素性浸潤,肺實質(zhì)纖維蛋白性壞死性炎癥,繼以患病肺部出現(xiàn)貧血性壞死,常伴有漿液性、纖維素性胸膜炎為特征。本試劑盒適用于檢測呼吸道、肺部等樣本中的牛肺炎,用于牛肺炎感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù),設計一對牛肺炎特異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光PCR技術(shù)對牛肺炎的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
CBP酶液 | 25μL×1管 |
CBP反應液 | 975uL×1管 |
CBP陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融不超過5次,有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
疑似患病牲畜取呼吸道樣本或胸、肺部樣本進行檢測。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標本運送應采用2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
組織樣品:每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;分泌液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進行提取,嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應體系配制如下表:
試劑 | CBP反應液 | 酶液 |
用量(樣本數(shù)為N) | 19.5μL | 0.5μL |
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR擴增(核酸擴增區(qū))
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi);
4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM檢測牛肺炎,淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
2 | 40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設定
設置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑:檢測通道35.0<Ct值<38.0,且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關;
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;
? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;
? 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;
? 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線且無Ct值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30;
以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
8. 性能指標
(1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評價敏感性98%以上。最DI檢測限不低于1000copies/ml。
(2)特異性:100%。
(3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,完全混勻并短暫離心;
? 反應液應避光保存;
? 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理
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