貨號(hào):YJ2445 規(guī)格:25管/24樣
線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說明書
可見分光光度法
正式測定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同時(shí)輔基 FAD 還原為 FADH2,后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,是呼吸電子傳遞鏈的支路。
測定原理
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰,通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制
試劑一:25mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:5mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:0.5 mL×1 支,-20℃保存;
試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;
試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;
試劑七:液體 2.5mL×1 瓶,4℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g,4℃離心 5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
4、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ(此步可選
做)。
5、 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至605nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前把試劑五和試劑六轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺乳
動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑 4℃可保存一周;
(2)在1mL 玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑七和800μL工作液,立即混勻,記錄 605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算 ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T
=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=113×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,9.4×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104L/mol /cm;
d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;
T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)
菌總數(shù),500 萬。