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葡萄糖含量試劑盒說明書(測組織、細菌或細胞) 微量法
點擊次數(shù):1483 更新時間:2019-10-23

                                                           規(guī)格:100管/96樣

葡萄糖含量試劑盒說明書(測組織、細菌或細胞)

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

葡萄糖不僅是細胞能量代謝的主要底物,而且其代謝中間產物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產生葡萄糖。就哺乳動物而言,葡萄糖不僅是大腦神經系統(tǒng)、肌肉、脂肪組

織等的唯yi能源,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關。

測定原理:

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并產生過氧化氫;過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水

試劑的組成和配制:

試劑一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 10ml×1 瓶,4℃保存;

試劑三:液體 10ml×1 瓶,4℃保存;

葡萄糖提?。?/span>

1、組織的處理:按照組織質量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),研磨成勻漿,95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心10min,取上清液備用。

2、細菌或細胞處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL蒸餾水),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復30次),95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至505nm,蒸餾水調零。

2、混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合,用多少配多少。

3、加樣表(在EP管或96孔板中加入下列試劑):

試劑(μL)

空白管

標準管

測定管

樣本

 

 

20

試劑一

 

20

 

蒸餾水

20

 

 

混合試劑

180

180

180

混勻,置 37℃(哺乳動物)或 25'C(其它物種)保溫 15min 后,于 505nm 波長處讀取吸光

度。空白管、標準管和測定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3。空白管和標準管只要做一管。

葡萄糖含量計算:

1、按樣本蛋白濃度計算

葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標準×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)

=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。

2、按樣本鮮重計算

葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)= (C 標準×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W

3、按細菌或細胞密度計算

葡萄糖含量(µmol/104cell)= (C 標準×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)

=0.001×(A3-A1)÷(A2-A1)

C 標準:標準管濃度,0.5µmol/mL;V1:加入樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1mL;

Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

注意:低檢測限為 50nmol/g  鮮重或 0.5nmol/mg prot

 

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