AxyPrep無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒
本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,結(jié)合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA。同時(shí)采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除內(nèi)毒素,可從 80-200 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取出多至 500 礸 高純度質(zhì)粒 DNA,其內(nèi)毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下。
一、 試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
| Cat. No. | AP-MX-EP-2 | AP-MX-EP-10 | AP-MX-EP-25 | |||
| 制備次數(shù) | 2 preps | 10 preps | 25 preps | |||
| 制備管(Maxiprep column) |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
| 大量濾器(Maxiprep syringe filter) |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
| RNase A | 48 µl | 270 µl | 700 µl | |||
| Buffer S1 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer S2 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer S3K | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer B | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer W1 | 3 | ml | 160 | ml | 350 | ml |
| Buffer W2 concentrate | 15 | ml | 66 | ml | 150 | ml |
| ET-free water (70% Ethanol) | 1.8 | ml | 7.5 | ml | 18 | ml |
| Eluent A | 8 | ml | 30 | ml | 70 | ml |
| Buffer ETR | 10 | ml | 50 | ml | 120 | ml |
| Buffer PF | 3 | ml | 13 | ml | 30 | ml |
| 說(shuō)明書(shū) |
| 1 |
| 1 |
| 1 |
RNase A:50 mg/ml,室溫可貯存 6 個(gè)月,長(zhǎng)期貯存于-20℃。
Buffer S1:細(xì)菌懸浮液。加入 RNase A 后,混合均勻,4℃貯存。
Buffer S2:細(xì)菌裂解液(含 SDS/NaOH),室溫密閉貯存。
Buffer S3K:中和液,室溫密閉貯存。
Buffer B:DNA 結(jié)合溶液,室溫密閉貯存。
Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇(可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇)?;旌暇鶆?,室溫密閉貯存。
ET-free water (70% Ethanol):使用前,按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇(可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。
Eluent A:洗脫液。室溫密閉貯存。
Buffer ETR:內(nèi)毒素去除液。室溫密閉貯存。
Buffer PF:分相緩沖液。室溫密閉貯存。
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二、 注意事項(xiàng)
三、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
四、 操作步驟
取 80-200 ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基,菌液體積應(yīng)減半或更少),3,000 ×g 離心 8 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,除盡上清。
加 10 ml Buffer S1,懸浮細(xì)菌沉淀,懸浮需均勻,不應(yīng)留有小的菌塊。
確認(rèn) Buffer S1 中已加入 RNase A。
加 10 ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò) 5 min。
避免劇烈搖晃,否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染。
此步驟不宜超過(guò) 5 min。
5.加 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer B,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合 10 次,8,000×g 離心(4℃)10 min。
步驟 6-9 可以選擇離心法或負(fù)壓法。
6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液,轉(zhuǎn)移到大量濾器(Maxiprep syringe filter)中。
7A. 插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。
8A. 棄濾液,加 12 ml Buffer W1 至制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。
9A. 棄濾液,加 14 ml Buffer W2 至制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。
6B. 正確連接負(fù)壓裝置,將大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。
7B. 吸取步驟 5 中的上清液,轉(zhuǎn)移到大量濾器中,插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。
8B. 保持負(fù)壓,加 12 ml Buffer W1,吸盡管中溶液。
9B. 保持負(fù)壓,加 14 ml Buffer W2,吸盡管中溶液。
確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2,≥6,000×g 離心 5 min。
將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中,在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,室溫靜置 5 min,≥6,000×g 離心 5 min 收集質(zhì)粒 DNA。
將 Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。
棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預(yù)冷的 Buffer ETR,混合均勻。
如果 Buffer ETR 渾濁,于冰上靜置,直至溶液變得清亮;如果分層,則混合均勻。
加入 1 ml Buffer PF,混合均勻。
*溶液可能會(huì)出現(xiàn)微弱的渾濁現(xiàn)象,此為正?,F(xiàn)象。
置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min。
孵育后溶液將出現(xiàn)大量乳白色沉淀,否則延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
孵育后溶液有可能出現(xiàn)分層現(xiàn)象,此為正?,F(xiàn)象。
此步驟的離心必須使用吊籃式(swing-out rotor)離心機(jī)或其他水平離心機(jī)
取無(wú)色上相至 50 ml 離心管中,加入 0.8 倍體積異丙醇(如:取得 6 ml 無(wú)色上相,則加入 4.8 ml 異丙醇),混合均勻。室溫靜置 10 min。8,000×g 離心 10 min。盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預(yù)冷的 ET-free water(70% Ethanol),洗滌沉淀,8,000×g 離心 5 min。
ET-free water(70% Ethanol)使用前確定已加入體積的無(wú)水乙醇。
盡可能棄盡上清。在超凈臺(tái)中干燥 10-15 min。
管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。
加入 500 祃 Eluent A 或無(wú)內(nèi)毒素水溶解質(zhì)粒 DNA。
總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒說(shuō)明書(shū)(微量法)