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牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說明書
點(diǎn)擊次數(shù):1693 更新時(shí)間:2019-11-27

牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)

英文名稱:Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對牛傳染性胸膜肺炎基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號

組成

25T/盒

50T/盒

1

牛傳染性胸膜肺炎  PCR反應(yīng)液

 437.5μL×1管

875μL×1管

2

牛傳染性胸膜肺炎 混合酶液

  62.5μL×1管

125μL×1管

3

牛傳染性胸膜肺炎 陽性對照

   40μL×1管

 40 μL×1管

4

牛傳染性胸膜肺炎 陰性對照

   40μL×1管

 40 μL×1管

5

DNA提取液

1.5 mL×1管

1.5 mL×2管

6

說明書

1份

1份

注:陰性對照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物,陽性對照為牛傳染性胸膜肺炎經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲存條件及有效期】避光-20以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 動(dòng)物組織樣本采集后取10mg~100mg用滅菌生理鹽500μL~1000μL水研磨,離心后取上懸液備用,避免標(biāo)本間交叉污染。

2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃~-80℃,長期保存不會影響本試劑盒檢測結(jié)果,但有可能影響培養(yǎng)法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液(Taq酶+UNG酶)

 2.5 μL

(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作?;虬匆韵路椒ú僮鳎?/span>

a.取試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞過來的DNA提取液,2000 rpm 離心10 s后備用。

b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL,加入到1.5 mL無菌離心管中,12000 rpm離心5 min后,吸干上清,保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL,將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min,取上清用于PCR檢測。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

 

4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集牛傳染性胸膜肺炎

熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

50:2分鐘(min)

1

預(yù)變性

95:3分鐘(min)

1

預(yù)擴(kuò)增

95:5秒(s)

5

55:40秒(s)

PCR擴(kuò)增

95:5秒(s)

40

55:40秒(s)

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【陽性判斷值或者參考區(qū)間】

1.試劑盒有效性判定:

(1)陽性對照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出牛傳染性胸膜肺炎

陽性(+)

標(biāo)本中檢測出牛傳染性胸膜肺炎

【檢驗(yàn)方法的局限性】

  • 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
  • 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102CFU,產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

  • 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
  • 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
  • 為保證試劑不受標(biāo)本污染,必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。
  • 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心。
  • 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在di一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。
  • 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
  • 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。
  • ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
  • 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。

 豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體(IgG)診斷試劑盒

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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