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β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)試劑盒說(shuō)明書
點(diǎn)擊次數(shù):1780 更新時(shí)間:2019-12-05

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)試劑盒說(shuō)明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

β-GC(EC 3.2.1.21)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化β-糖苷鍵水解, 具有多方面生理作用:在纖維素的糖化作用中,β-GC 負(fù)責(zé)進(jìn)一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖;β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體,使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味;

β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷,釋放 HCN,從而防止昆蟲取食。

測(cè)定原理:

β-GC 分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,后者在 400nm 有大吸收峰, 通過測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算β-GC 活性。

自備用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 12mL 蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè):提取液體積mL500~10001 的比例建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞冰浴,功率 20%200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);15000g

4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例建議稱取約 0.1g 組織, 加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

試劑名稱(μL)

測(cè)定管

對(duì)照管

試劑一

120

 

試劑二

150

150

樣本

30

30

充分混勻,放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后,立即放入 95℃水浴 5min蓋緊,以防止水分散失

流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)

試劑一

 

120

 

充分混勻,8000g,4℃,離心 5min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑)

上清液

70

70

試劑三

130

130

充分混勻,室溫靜置 2min 后,400nm 處測(cè)定吸光值 A,計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

β-GC 活力計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.32x-0.0027;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y 為吸光值。

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.125×(ΔA +0.0027)

Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),

500 萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,0.5h。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.16x-0.0027;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y 為吸光值。

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=125×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=125×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.25×(ΔA +0.0027)

 

Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),

500 萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,0.5h。

Ca++ Mg++-ATP酶活性測(cè)定說(shuō)明書

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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