還原糖含量試劑盒說明書
可見分光光度法
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
還原糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等,是zui常見的單糖和雙糖,其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物,也是進(jìn)一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。
測定原理:
加熱促進(jìn)堿性溶液中 3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物,在540nm 有特征吸收峰;在一定的濃度范圍內(nèi),還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可求出樣品中還原糖的量。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:20mL×1 瓶 ,4℃保存;
樣品中還原糖的提?。?/span>
1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議1000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入2mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復(fù)30次),轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中(防止加熱時(shí)水分散失),80℃水浴中40min 并且振蕩8~10 次,8000g,25℃離心 10min,取上清供測定用。
2、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.2g
組織,加入2mL試劑一),冰浴勻漿,轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中(防止加熱時(shí)水分散失),80℃水浴中40min 并且振蕩8~10次,8000g,25℃離心10min,取上清供測定用。
3、血清(漿)的處理:按照血清(漿)體積(mL):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建
議取0.2mL血清(漿)加入2mL試劑一),冰浴勻漿,轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中(防止加熱時(shí)水分散失),80℃水浴中 40min 并且振蕩 8~10 次,8000g,25℃離心10min,取上清供測定用。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95℃。
3、 在 EP 管中加入下列試劑:
試劑(μL) | 對照管 | 測定管 |
樣本 | 700 | 700 |
試劑二 |
| 500 |
蒸餾水 | 500 |
|
將各管搖勻,在 95℃水浴中加熱 5min(蓋緊,防止水分散失),取出后立即冷卻至室溫,
混勻。在 540nm波長下讀取對照管和測定管吸光值。計(jì)算 ΔA=A 測定-A 對照。
注意:1、每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。
2、如果 ΔA大于2,需要將樣本用試劑一稀釋,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
還原糖含量計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y =8.5067x-2.0807;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算:
還原糖 (μg/g 鮮重 )=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)
=235×(ΔA +2.0807)÷W
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算:
還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)
=117.55 ×(ΔA+2.0807)÷Cpr
4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
還原糖(μg/104cell)=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(1000×V1÷V2)
=0.235×(ΔA+2.0807)
5、按血清(漿)體積計(jì)算:
還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA+2.0807) ÷8.5067×V1]÷(V3×V1÷V2)
=1175.5×(ΔA+2.0807)
1000:1mg/mL=1000µg/mL;V1:加入樣本體積,0.7mL;V2:加入提取液體積,2 mL;V3:加入血清(漿體積),0.2mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;1000:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),1000 萬。
注意:低檢測限為 1mg/g 鮮重或 10μg/mg prot