β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)試劑盒說明書
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下,可誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA 活性測(cè)定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。
測(cè)定原理:
β-1,3-GA 水解昆布多糖,內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生還原末端,通過測(cè)定還原糖生成速率來(lái)計(jì)算其酶活性。
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存;
試劑二:液體 30mL×1 瓶,4℃保存;
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或 200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);12000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
樣本 | 35 | 35 |
蒸餾水 |
| 35 |
試劑一 | 35 |
|
充分混勻,放入 37℃水浴 60 min | ||
試劑二 | 230 | 230 |
充分混勻,95℃水浴 5min(蓋緊,防止水分散失),流水冷卻,取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中, 550nm處記錄各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸餾水稀釋后測(cè)定(計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
β-1,3-GA 活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=0.0958x-0.0192;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)
=10.438×(ΔA +0.0192)÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(W×V1÷V2)
= 10.438×(ΔA +0.0192)÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.0208×(ΔA+0.0192)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.035mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y =0.0479x-0.0192;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h/mg prot)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(V1×Cpr)
=20.876×(ΔA +0.0192)÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(W×V1÷V2)
= 20.876×(ΔA +0.0192)÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.0416×(ΔA+0.0192)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.035mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。