蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)試劑盒說明書
微量法
正式測定管前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
蔗糖不僅是重要的光合產(chǎn)物,也是植物體內(nèi)運輸?shù)闹饕镔|(zhì),還是碳水化合物的貯存形式之一。SPS(EC 2.4.1.14)以果糖-6-磷酸為受體,形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。
測定原理
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。
需自備的的儀器和用品
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;
試劑三:液體 2mL×1 瓶,4℃保存
試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:液體 6mL×1 瓶,4℃保存;
樣品測定的準備:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至480nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定(在 EP 管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 10 | 10 |
|
|
蒸餾水 |
| 45 | 45 | 55 |
試劑二 |
|
| 10 |
|
試劑一 | 45 |
|
|
|
混勻,25℃準確水浴 10min | ||||
試劑三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸 10min 左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻 | ||||
試劑四 | 210 | 210 | 210 | 210 |
試劑五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測定各管吸光值。標準管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。
SPS 活力單位的計算
1、按照蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS 活性(μg /min/mg prot)= {C 標準管×V1×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管))÷(V1×Cpr)÷T=100×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr
2、按照樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS 活性(μg /min/g 鮮重) = {C 標準管×V1×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管))÷(W×V1÷V2)÷T=100×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W
C 標準管:標準管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;T :反應(yīng)時間:10min。
常量多酚氧化酶檢測試劑盒(PPO)操作步驟