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ATP含量試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法
點(diǎn)擊次數(shù):1408 更新時(shí)間:2021-09-24

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ATP含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

ATP廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是生物能量通貨,能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定ATP含量并且計(jì)算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測(cè)定原理:

肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測(cè)磷酸肌酸含量,以此反應(yīng)ATP含量。

自備儀器和用品:

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制:

酸性提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 堿性提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:粉劑×1 支,4℃保存;臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃ 保存;

試劑二:液體 1.5mL×1 支,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑四:液體 5mL×1 瓶,4℃保存; 試劑五:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;

標(biāo)準(zhǔn)液:液體 10mL×1 瓶,2μmol/mLATP 標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存;

ATP 提?。?/span>

1、血清(漿ATP的提?。?/span>按照血清(漿體積(mL):酸性提取液體積mL) 1:5~10 的比例(建議取約0.1mL血清(漿,加入1mL酸性提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離 10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g4 ℃ 離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。

2、組織中 ATP 的提?。?/span>按照組織質(zhì)量g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離心10min,取上清至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量104 個(gè)):酸性提取液體積(mL) 500~1000:1 的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 酸性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W,超聲2s,停1s),8000g 4 ℃離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4℃ 離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。


 

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到700nm,蒸餾水調(diào)零。

2、顯色劑的配制:臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用顯色劑體積(樣本數(shù)×0.2 mL),按試劑四(mL):試劑五(mL)=1:5 的比例配制。用多少配多少。

3、樣本測(cè)定:

試劑名稱(μL)

測(cè)定管

對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)管

空白管

樣本

10

10



標(biāo)準(zhǔn)液



10

10

試劑一

20


20


試劑二

10

10

10

10

試劑三

10


10


蒸餾水


30


30

充分混勻,37℃準(zhǔn)確水浴 30min

顯色劑

200

200

200

200

37℃水浴20min后,700nm下測(cè)定各管吸光值

注意 空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

ATP 含量計(jì)算:

1、血清(漿)中ATP含量計(jì)算

ATP含量(μmol/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V1]÷(V3×V1÷ V2)=40×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP含量計(jì)算

(1) 按蛋白濃度計(jì)算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V1]÷(V1÷ Cpr)=2×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

ATP含量(μmol/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V1]÷(W×V1÷ V2)=4×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

ATP含量(μmol/104cell)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V1]÷(500× V1÷V2)=0.008×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)液濃度,2μmol/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

注意:最DI檢測(cè)限為 10nmol/mL 或10nmol/g鮮重或 0.1nmol/mg prot

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 


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