FastTaqMan Mixture（With ROX）說明書
Cat. No. K2390
保存：-20℃避光
如需頻繁使用，2-8℃保存，盡量避免反復凍融。
組分說明
2×FastTaqMan Mixture
Cat. No. Kit Size RNase-Free Water（With ROX）
K2390 50 μl 反應×40 次（1 ml） 1 ml 1 ml
K2390A 50 μl 反應×200 次（5 ml） 5×1 ml 5 ml
產(chǎn)品簡介
FastTaqMan Mixture(With ROX)是專用于探針法(TaqMan，Molecular Beacon 等）實時熒光定量 PCR 的預混體系，濃度為 2×,包含 Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg 2+ 和 ROX 校正染料，操作簡單方便。主要用于基因組 DNA 靶序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 靶序列檢測。本品含有的 Fast Taq DNA Polymerase，能有效減少在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴增，酶的激活僅需在 95℃孵育 30s。整個 PCR 反應過程比普通反應可節(jié)省約 40 分鐘，大大縮短了 PCR 的反應時間。*的 PCR 緩沖體系與快速熱啟動酶的組合，有效抑制了非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，并顯著提高了 PCR 的擴增效率，熒光信號更強，靈敏度更高，線性范圍更寬。該產(chǎn)品適用范圍廣，可用于普通和快速定量 PCR 程序。所含的 ROX 染料可校正定量 PCR 儀孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差, 適用于以 ROX 作為校正染料的熒光定量 PCR 儀。
注意事項
1 使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。
2 本產(chǎn)品中含有熒光染料 ROX，保存本產(chǎn)品或配制 PCR 反應液時應避免強光照射。
3 避免反復凍融本品，反復凍融可能使產(chǎn)品性能下降。本產(chǎn)品長期保存可置于-20℃，避光。如果在短期內(nèi)需要頻繁使 用，可在 2-8℃保存。
使用方法
以下舉例為常規(guī)的反應體系和反應條件，實際操作中應根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小的不同進行相應的改進和優(yōu)化。
1. PCR反應體系：
試劑 50 μl反應體系 終濃度
2×FastTaqMan Mixture（With ROX） 25 μl 1×
Forward Primer，10 µM 1μl 0.2 μM 1）
Reverse Primer，10 µM 1μl 0.2 μM 1）
Probe，10 μM 1μl 0.2 μM 2）
Template DNA 2 μl 3）
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：1）通常引物濃度以0.2 μM可以得到較好結(jié)果，可以在0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；
發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
2）所用探針的終濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標記物質(zhì)種類有關(guān)，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行濃度的調(diào)節(jié)。
3）通常DNA模板的量以10-100 ng基因組DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。
2. PCR反應程序：
兩步法PCR：
步驟 溫度 時間
預變性 95℃ 30 s 1）
變性 95℃ 5 s
35-40 個循環(huán)
退火/延伸 2） 60℃ 30 s
注意：1）本產(chǎn)品所采用的酶須在預變性95℃、30s條件下實現(xiàn)酶的活化。在此條件下，大多數(shù)模板可良好的進行解鏈。對GC含量高、二級結(jié)構(gòu)復雜的模板，可將預變性時間延長至1～4分鐘，以使起始模板充分解鏈。
2）建議采用兩步法PCR反應程序，若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，退火溫度請以 56℃-64℃的范圍作為設定參考。
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