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禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒產品性能
點擊次數:669 更新時間:2022-06-13

禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒

禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒

RT-PCR熒光探針法)

產品概述

本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,在反應體系中含AIV-H5N1基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

試劑盒組成】

組成成份

包裝規(guī)格

AIV-H5N1 PCR反應液

875μl

AIV-H5N1混合酶液

125μl

陰性對照

40μl

AIV-H5N1陽性對照

40μl

儲存條件及有效期

-20℃避光保存,避免反復凍融,有效期6個月。

適用儀器

ABI7300ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

樣本采集、存放及運輸

u 樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集;

u 存放:樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h,-70℃以下可長期保存,但應避免反復凍融(最多凍融3次);

u 運輸:采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。

自備試劑

核酸提取試劑,如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒,也可選擇其他合適的核酸提取產品。

使用方法

注:所有試劑使用前需*解凍,混合均勻,6,000rpm離心數秒后使用。

1. 樣本處理(樣本處理區(qū))

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等,具體提取方法請參照相關說明書;陽性對照及陰性對照無需提取,可直接使用。

2. 擴增試劑準備(PCR前準備區(qū))

N個(N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照)PCR反應管,每管分別加入PCR反應液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據每頭份用量計算N+1PCR反應液、混合酶液所需總量,兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應管)。

組分

每頭份用量

AIV-H5N1 PCR反應液

17.5 μl

AIV-H5N1混合酶液

2.5 μl

      將所有PCR反應管于6,000rpm離心30s,轉移至樣本處理區(qū)。

      3. 加樣(樣本處理區(qū))

   在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl,蓋緊管蓋,于6,000rpm離心10s,轉移至擴增區(qū)。

   * 注意事項:建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。

      4. PCR擴增(擴增區(qū))

1)      儀器設置(以ABI Prism 7500為例)

PCR反應管放入PCR儀內,按照對應順序設置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)

FAM通道采集AIV-H5熒光信號,HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher DyeNone,參比染料(Passive Reference) None

2)      擴增程序

        4210min

        95 3min

95  5sec

55  40sec

        95  5sec

        55℃  40sec

        40Cycles55℃采集熒光信號,反應體系為25 μl。

結果分析條件設定

u 基線(Baseline)設定:應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域(所有樣本熒光信號無較大波動),起始點(Start)應避開熒光采集起始階段的信號波動,終止點(End)應比最早出現(xiàn)指數擴增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán),建議基線設為3~15

u 閾值(Threshold)設定:將閾值線設定在剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

質控標準

1.   陰性對照的檢測結果應為陰性,Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期;

2.   陽性對照的檢測結果應為陽性,有典型S型擴增曲線或Ct35

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足,否則該次實驗視為無效。

結果判斷

1.   陽性:標本檢測結果Ct35并有明顯指數增長期;

2.   可疑:有明顯的指數擴增期,且35Ct38,此時樣本為可疑樣本;對于可疑樣本建議復核一次,若復核結果Ct≤38且有指數擴增期,則判定為陽性,否則判定為陰性;

3.   陰性:無指數擴增期,Ct38或無Ct值均判定為陰性樣本。

對檢驗結果的解釋

通道及檢測結果

標本檢測結果解釋

FAM

 

+

+

標本中檢出AIV-H5AIV-N1

+

標本中檢出AIV-H5,未檢出AIV-N1

+

標本中檢出AIV-N1,未檢出AIV-H5。

標本中未檢出AIV-H5AIV-N1

試劑盒使用注意事項

1.   有關實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2.   本試劑盒僅用于體外檢測。

3.   實驗請嚴格分區(qū)操作:

第一區(qū):PCR前準備區(qū)準備擴增所需試劑;

第二區(qū):樣本處理區(qū)待測樣本和對照品處理;

第三區(qū):檢測區(qū) — PCR擴增檢測。

4.   各區(qū)物品均為專用,不得交叉使用,避免污染,實驗后即請清潔工作臺;

5.   試劑盒內各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。

6.   在-20℃保存的樣本裂解產物,應在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。

7.   分裝有反應液的檢測管裝入密實袋內再轉移至樣本區(qū)。

8.   加樣時應使樣品*落入反應液中,不應有樣品粘附于管壁上,加樣后應盡快封上檢測管蓋。

9.   擴增完畢立即取出檢測管,密封在專用塑料袋內,丟棄于指D地點。

10.   反應液分裝時應盡量避免產生氣泡,上機前注意檢查各反應管是否蓋緊,以免熒光物質泄露污染儀器。

11.   實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12.   工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。

 

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