口蹄疫病毒通用型(FMDV-U)核酸檢測試劑盒(熒光 RT-PCR 法)
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:口蹄疫病毒通用型(FMDV-U)核酸檢測試劑盒(熒光 RT-PCR 法)
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【貨
號】 XC-2010
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標本中口蹄疫病毒 RNA, 適用于口蹄疫病毒感染
的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 RT-PCR 技術(shù),通過設計 1 對口蹄疫病毒特異性引物,結(jié)合 1 條特異性探針,用熒光 RT-PCR
技術(shù)對口蹄疫病毒核酸進行體外擴增檢測, 用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名
稱
規(guī)
格
酶液
50μL×1 管
FMDV-U 反應液
950uL×1 管
FMDV-U 陽性質(zhì)控品
50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品
50μL ×1 管
備注:不同批號的試劑盒組分不宜交叉使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃, 避光保存、運輸、反復凍融≤5 次, 有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P、Bio-Rad 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺豬,取分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃, 長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月, 標本運送應采用2~8℃冰袋運輸, 嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
組織樣品: 每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g, 手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g于研磨器中研磨, 加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)
研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中, 8000rpm 離心 2min, 取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中; 全血樣本:待血凝固后,
取血清 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2
RNA 提取
推薦采用深圳市迅測生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取法/磁珠法),請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù), 設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照,每個測試反應體系配制如下表:
試劑
FMDV-U 反應液
酶液
用量(樣本數(shù)為 N)
19μL
1μL
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL, 分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);
4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道選擇 CY5 檢測, 淬滅通道選擇 NONE, 參比熒光選 NONE。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置:
步驟
循環(huán)數(shù)
溫度
時間
收集熒光信號
1
1 cycle
50℃
15min
否
2
1 cycle
95℃
3min
否
3
45cycles
95℃
15sec
否
55℃
30sec
是
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold: 一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start
值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),
重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤38.0, 且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑:檢測通道 Ct 值>38.0, 且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤38.0 和典型擴增曲線者為陽性,
否則為陰性。
陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
6. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期, 且 Ct 值≤30;
以上條件應同時滿足, 否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏, 會導致假陽性結(jié)果;
? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;
? 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;
? 本檢測結(jié)果僅供參考, 如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化, 完全混勻并短暫離心;
? 反應液應避光保存;
? 反應中管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行, 以免交叉污染;
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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