兔腫瘤組織巨噬細胞分離液KIT實驗方法
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
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| 名稱 |
| 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 |
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| A | 試劑 A |
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| 200ml |
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| B | 試劑 C |
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| 200ml |
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| C | 樣本稀釋液（贈品） |
| 2010C1119 | 200ml |
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| D | 清洗液（贈品） |
| 2010X1118 | 200ml |
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| E | F 液（贈品） |
| F2013TBD | 200ml |
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| F | 說明書 |
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| 1 份 |
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【實驗前準備】 |
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A． 適用儀器 |
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| zui大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機 |
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B． 耗材 |
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| 產(chǎn)品名稱 |
| 產(chǎn)品貨號 |
| 產(chǎn)地 |
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| 15ml 離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國 NUNC |
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| 15ml 離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國 NUNC |
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| 50ml 離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國 NUNC |
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| 50ml 離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國 NUNC |
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| 無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗方法】 |
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全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
- 首先制備組織單細胞懸液，制備方法詳見“組織單細胞懸液制備技術”。
- 取一支 15ml 離心管，先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 C，制成梯度界面。
- 用吸管小心吸取組織單細胞懸液加于分離液液面上，400-550g，離心 20-30min。（注： 根據(jù)組織單細胞懸液量確定離心條件，組織單細胞懸液量越大，離心力越大，離心時間 越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果）。
- 離心后，此時離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細胞層。
- 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
- 250g，離心 10min。
- 棄上清。
- 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
- 250g，離心 10min。
- 重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
- 差異貼壁法純化細胞 （1）用巨噬細胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CTBD2015MAC）或巨噬細胞*培養(yǎng)基 （產(chǎn)品編號：HCTBD2015MAC）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次 性細胞板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。 （3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細胞、干細胞。 （4）不貼壁的為淋巴細胞。
注：
- 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
- *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細胞而定）。
- 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
【注意事項】
- 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結(jié)果，zui 好在取樣 2h 內(nèi)進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后 分離效果更差甚至不能達到分離目的。
- 本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面，影響細胞分離效果。
- 吸取過多的乳白色細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的
粒細胞數(shù)量增加。
- 分離液用量大于組織單細胞懸液樣本時，分離效果更佳。
- 如實驗后細胞得率或活性過低，請以尋求幫助，具體詳 見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗巨噬細胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
| 紅細胞 |
| 白細胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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含量（個/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細胞 | 淋巴細胞 | 單核細胞 | （1.0-3.0）×1011 |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關實驗技術方案】
- 組織單細胞懸液制備技術。
- 所獲得巨噬細胞的培養(yǎng)技術。
- 所獲得巨噬細胞的核酸提取技術。
- 所獲得巨噬細胞的鑒定方法 A.流式細胞技術 B.免疫組化技術 C.原位雜交技術
D.PCR 技術
注：上述技術方案詳情請登陸本搜索“細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 |
| 建議解決方案 | |
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離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當增減轉(zhuǎn)速 | ||
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離心后目的細胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 | |||
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| 離心后白環(huán)層彌散 | 細胞密度過大 | 調(diào)整細胞密度 |
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| 離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細胞密度過小 | |
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- 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離 心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
- 本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。
