葡萄糖含量試劑盒說(shuō)明書 |
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葡萄糖含量試劑盒說(shuō)明書 微量法 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 測(cè)定意義: 葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物,而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過(guò)光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言,葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組 織等的WEI一能源,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。 測(cè)定原理: 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并產(chǎn)生過(guò)氧化氫;過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。 需自備的儀器和用品: 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水 試劑的組成和配制: 試劑一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 10ml×1 瓶,4℃保存; 試劑三:液體 10ml×1 瓶,4℃保存; 葡萄糖提?。?/span> 1、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),研磨成勻漿,冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復(fù)30次后,8000g,25℃離心10min,取上清液備用。 2、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復(fù)30次),95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。 3、其他類液體,離心后可直接取上清檢測(cè)。 測(cè)定步驟: 1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm,蒸餾水調(diào)零。 2、混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合,用多少配多少。 3、加樣表(在EP管或96孔板中加入下列試劑):
混勻,置 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25'C(其它物種)保溫 15min 后,于 505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光 度。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。 葡萄糖含量計(jì)算: 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算 葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr) =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。 2、按樣本鮮重計(jì)算 葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W 3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 葡萄糖含量(µmol/104cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2) =0.001×(A3-A1)÷(A2-A1) C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5µmol/mL;V1:加入樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。 注意:低檢測(cè)限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot
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