β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)試劑盒說明書 |
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β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)試劑盒說明書 微量法 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義: β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下,可誘導細胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA 活性測定廣泛應用于植物病理和逆境生理研究。 測定原理: β-1,3-GA 水解昆布多糖,內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生還原末端,通過測定還原糖生成速率來計算其酶活性。 自備儀器和用品: 可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制: 提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存; 試劑二:液體 30mL×1 瓶,4℃保存; 粗酶液提?。?/span> 1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或 200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);12000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 2、按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL 提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。 測定步驟 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,蒸餾水調(diào)零。 2、樣本測定(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑):
充分混勻,95℃水浴 5min(蓋緊,防止水分散失),流水冷卻,取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中, 550nm處記錄各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式乘以相應稀釋倍數(shù)),ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。 β-1,3-GA 活性計算: a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下 標準條件下測定回歸方程為y=0.0958x-0.0192;x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。 (1) 按蛋白濃度計算 單位的定義:每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr) =10.438×(ΔA +0.0192)÷Cpr (2) 按樣本鮮重計算 單位的定義:每g組織每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(W×V1÷V2) = 10.438×(ΔA +0.0192)÷W (3) 按細菌或細胞密度計算 單位的定義:每1萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0208×(ΔA+0.0192) V1:加入反應體系中樣本體積,0.035mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。 b.用96孔板測定的計算公式如下 標準條件下測定回歸方程為y =0.0479x-0.0192;x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。 (1) 按蛋白濃度計算 單位的定義:每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/mg prot)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(V1×Cpr) =20.876×(ΔA +0.0192)÷Cpr (2) 按樣本鮮重計算 單位的定義:每g組織每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(W×V1÷V2) = 20.876×(ΔA +0.0192)÷W (3) 按細菌或細胞密度計算 單位的定義:每1萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(mg/h /104cell)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0416×(ΔA+0.0192) V1:加入反應體系中樣本體積,0.035mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。 |